Científicos de la U. de Chile utilizan proteína lumínica de luciérnagas para cuantificar anticuerpos neutralizantes del virus causante del COVID-19
por El Mostrador Cultura 30 septiembre, 2020
Científicos del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile (ICBM) presentaron en una publicación preliminar los primeros resultados de validación de un sistema para la detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes contra el virus SARS-CoV-2, herramienta que podría masificar la caracterización de la respuesta inmune mediada por anticuerpos en pacientes COVID-19. La investigación, realizada en una muestra de 35 pacientes, es el primer estudio sobre anticuerpos neutralizantes en el país.
El sistema tiene tres eslabones claves: VIH inactivo, la proteína de superficie Spike del nuevo coronavirus y su receptor ACE2, y una proteína denominada luciferasa, la misma que utilizan las luciérnagas para emitir luz. “Los ensayos convencionales utilizan medición de anticuerpos totales contra el virus mediante la técnica de ELISA, pero no todos los anticuerpos tienen la capacidad de proteger o neutralizarlo. Se necesita una herramienta que permita detectar ese tipo de anticuerpos específicos, los neutralizantes”, explica el Dr. Ricardo Soto-Rifo, líder del proyecto.
Junto con la validación de la efectividad de la herramienta, entre los hallazgos del estudio –aún sin revisión de pares– se expone que la mayoría de las muestras analizadas evidenciaron una respuesta neutralizante similar ante las dos cepas predominantes del virus (la Wuhan 1, de referencia, y su variante, G614), siendo esta última la más prevalente en secuencias obtenidas en el país, así como también en el resto de América y Europa.
El desarrollo, logrado por investigadores del Laboratorio de Virología Molecular del Programa de Virología del ICBM, puede ser utilizado con fines de investigación o clínicos en condiciones de bioseguridad nivel 2, similares a las de universidades y hospitales, ya que trabaja con un virus inactivo –no contagioso–, que no requiere su manipulación en un laboratorio de bioseguridad nivel 3. En este sentido, permite su implementación en laboratorios dedicados a diagnóstico, docencia e investigación, ya que no requiere del uso de muestras de SARS-CoV-2.
VIH disfrazado y luminiscencia
El grupo que lidera el Dr. Soto-Rifo en el ICBM se dedica al estudio del VIH desde hace varios años. En el actual contexto, los investigadores decidieron reconvertir algunas de sus capacidades y utilizar sus recursos para diseñar una prueba de detección más eficiente y accesible, que permitiera caracterizar la respuesta de anticuerpos neutralizantes de los pacientes que sufrieron la infección.
El protocolo consiste en la generación de un pseudotipo de VIH reportero de uso en laboratorio y sin poder de infección que simula la interacción entre la proteína spike del SARS-CoV-2 y el receptor ACE2 de la célula. La proteína spike es la “llave” que utiliza el virus para penetrar la célula y el receptor ACE2 es la cerradura que permite que el patógeno ingrese y se replique en el organismo. “Lo que hicimos fue vestir el VIH con la proteína superficie del coronavirus. Y así desarrollamos este sistema que nos permite medir y cuantificar anticuerpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 de manera muy específica en muestras de plasma o de sueros”, explica el académico.
Por otra parte, señala que dentro del genoma de VIH insertaron el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga, por lo que durante la infección con el pseudotipo de VIH es posible medir la luz emitida por esta proteína en el laboratorio. Esta luciferasa opera como un gen “reportero” dentro del protocolo, la cual posee la sensibilidad suficiente para realizar el ensayo en un formato miniaturizado que permite el análisis simultáneo de múltiples muestras.
La luminiscencia se genera al interior de la célula cuando los anticuerpos neutralizantes no están presentes, precisa la Dra. Carolina Beltrán, investigadora del ICBM y autora principal del trabajo. “Los anticuerpos neutralizantes son capaces de unirse a la proteína spike y bloquear la entrada del virus a la célula y por ende no se va a generar luz. Es decir, la intensidad o capacidad neutralizante de un anticuerpo es directamente proporcional a la disminución de luz, que es una señal indirecta de la entrada del virus a la célula”, detalla la científica.
La entrada del virus a la célula está dada por la interacción entre spike y el receptor ACE2, tras una manipulación genética de una línea celular que permite su expresión. “Luego de que ocurre el ingreso, comienza la maquinaria de replicación del virus, y como parte de esa replicación se va a emitir la luz. La ventaja de este gen reportero es que con muy poca luminiscencia podemos detectar y cuantificar, y esto le confiere ventaja sobre otras proteínas reporteras, como las proteínas fluorescentes”, agrega.
“Es una técnica bastante sensible”, subraya la Dra. Beltrán, quien también valora la agilidad en los resultados, pues es posible analizar múltiples muestras a la vez: cerca de un centenar cada 30 o 48 horas. “De esta manera podemos ver qué sueros de pacientes cuentan con anticuerpos neutralizantes y cuáles no”, afirma la investigadora.
Resultados
Tras un análisis piloto en muestras de 35 pacientes, incluyendo muestras de plasmas tanto de individuos sanos como de enfermos activos y recuperados, el estudio determinó que los pacientes expuestos a SARS-CoV-2 presentaron en un alto porcentaje (más de un 90 por ciento) anticuerpos neutralizantes capaces de neutralizar de manera muy similar las variantes de spike prevalentes a nivel mundial (D614 y G614), siendo esta última la de mayor prevalencia en Chile.
“Es una muestra muy pequeña que aún no permite extraer grandes conclusiones”, advierte el Dr. Soto-Rifo, “sin embargo, en general, la mayoría de los sueros que observamos neutralizan del mismo modo ambas variantes. Sólo en un porcentaje mínimo de la muestra observada la variante podría tener una menor o mayor susceptibilidad a los anticuerpos neutralizantes”.
“Tener eso en consideración es importante porque la mayoría de las vacunas están hechas utilizando la cepa de referencia, secuenciada en Wuhan, la que corresponde a la variante D614. Que un anticuerpo sea menos neutralizante no significa que no neutralice el virus, sino que necesito más anticuerpos para poder neutralizar un determinado tipo de variante. El virus puede alterar eventualmente una respuesta, pero de momento no han sido reportadas variantes de spike que confieran escape a los anticuerpos neutralizantes”.
Las muestras fueron obtenidas de la colaboración que el programa de Virología tiene con la Fundación Arturo López Pérez. Los resultados del estudio fueron enviados para su evaluación y publicación en una revista científica y serán depositados prontamente en el repositorio bioRxiv con la finalidad de que otros investigadores puedan acceder a los resultados obtenidos. Para los investigadores se trata de un primer paso para que la herramienta contribuya en próximos hitos de la pandemia en Chile.
El grupo, compuesto además por el Dr. Fernando Valiente y los estudiantes de doctorado Aracely Gaete, Aarón Oyarzún y Sebastián Riquelme, realiza esta tarea desde hace cinco meses, aportando resultados para el uso clínico de los anticuerpos neutralizantes en pacientes de la FALP.
Potenciales aplicaciones
Un paciente puede tener un alto número de anticuerpos totales, pero contar con una baja calidad de anticuerpos neutralizantes. Son estos últimos los que confieren al organismo la capacidad de protegerse frente a una nueva infección. Los investigadores señalan, tras su experiencia de varios meses apoyando el estudio de suero para transferencia de plasmas convalecientes en COVID-19, que no se trata necesariamente de una relación lineal.
Los anticuerpos neutralizantes son aquellos que van a reconocer las moléculas del virus y van a impedir su ingreso a la célula. Hasta ahora, con lo que se conoce del nuevo coronavirus, se cree que gran parte de los anticuerpos van dirigidos contra la proteína de superficie spike, específicamente contra una región conocida como RBD, que es la región de spike que hace contacto con el receptor ACE2. Esta interacción es clave para su alta capacidad infectiva.
La Dra. Beltrán apunta que la capacidad protectora de los anticuerpos se conoce como “títulos neutralizantes”. “Todos desarrollamos anticuerpos frente a cualquier partícula ajena a nuestro cuerpo. Es una reacción normal, pero existen anticuerpos que no son neutralizantes y otros que sí. Y estos pueden bloquear la entrada del virus a su receptor, a su célula, y son los más efectivos a nivel de inmunidad. Muchos anticuerpos no sirven para bloquear la infección”.
Para los investigadores, comprender este comportamiento inmune y validar una herramienta que lo cuantifique es el primer paso para transferir el protocolo hacia otros laboratorios, ya sea con fines clínicos o de investigación. Plantean que certificar la prolongación de la inmunidad (la primera barrera del organismo contra virus y bacterias) será fundamental mientras el virus permanezca circulando.
En los próximos meses, de hecho, el desarrollo será parte de dos iniciativas financiadas por la ANID para el estudio del COVID-19 en Chile, entre ellos el de inmunidad poblacional impulsado por investigadores de las facultades de Medicina y Ciencias de la Universidad de Chile. “Sabíamos que sería una herramienta útil tanto para fines clínicos como para estudiar la inmunidad a lo largo del tiempo”, expone el director del proyecto.
No hay comentarios:
Publicar un comentario